GENOTIPAGEM DE FRAGMENTOS
Oferecemos serviço de genotipagem de fragmentos de DNA a partir de produtos de PCR, utilizando o Genetic Analyser 3500XL, um sistema de análise de DNA de 24 capilares com a tecnologia Life Technologies – Applied Biosystems.
A genotipagem pode ser feita utilizando a matrix DS-33 (fluorescências 6-FAM – VIC – NED – PET – LIZ (marcador de peso molecular)), ou então utilizando a matriz DS-30 (6-FAM – HEX – NED – ROX (marcador de peso molecular)).
GENOTIPAGEM DE FRAGMENTOS DE DNA
Para a realização do serviço, as amostras devem ser entregues prontas para a corrida.
I – Primers
O primer (somente um dos primers do par) deve ser marcado com o fluorocromo na extremidade 5’. Uma alternativa econômica para quem quer usar vários marcadores é usar uma cauda de M13-fluorescente (Schuelke M., Nat Biotechnol. 2000 18:233-234).
O ABI3500XL permite as seguintes combinações de fluorocromos: Dye Set DS-30 para combinação de primers marcados com 6-FAM, HEX, NED e marcador de peso molecular ROX; ou Dye Set DS-33 para combinação de primers marcados com 6-FAM, VIC, NED, PET e marcador de peso molecular LIZ.
II – Size Standard
Utilizamos o GeneScan ROX 500 , LIZ 500, ou Liz 600 da Applied Biosystems que possuem fragmentos que variam de 20/35 a 500/600 bp. Recomendamos que os fragmentos de PCR tenham no mínimo 70bp e no máximo 500bp, para garantir uma análise mais acurada. O Size Standard é adicionado a cada um dos poços da placa de corrida, que corresponde a um capilar. O software usa o Size Standard para criar uma curva para cada capilar analisado, gerando uma análise individual e precisa.
DEVERÁ SER ENVIADO UMA ALÍQUOTA DO SIZE STANDARD EM UM TUBO SEPARADO DAS AMOSTRAS, PARA QUE A GENTE MISTURE SOMENTE NA HORA DA CORRIDA.
III - Amostras (produto de PCR)
Para a reação de PCR não recomendamos o uso de kits corados (Taq Green, REDTaq e outros similares) pois o corante pode danificar o capilar do equipamento, o ideal é verificar se o kit é indicado para genotipagem e sequenciamento.
A amostra de PCR precisa estar dessalinizada. Para a maioria dos casos é suficiente apenas diluir a PCR em H2O ultrapura, mas pode ser feito também utilizando colunas para purificação de PCR.
No geral, três a quatro PCRs diferentes podem ser misturadas para serem corridas num mesmo capilar, contanto que tenham sido marcadas com fluorocromos de cores diferentes. Se tiverem a mesma cor, devem ter tamanhos diferentes. É possível correr mais de quatro PCRs no mesmo capilar, mas o ideal é fazer um teste antes para verificar se as PCRs são limpas e não geram fragmentos inespecíficos que podem interferir na análise de outro marcador.
ENVIO DAS AMOSTRAS
As amostras deverão ser enviadas somente após autorização do orientador responsável pelo aluno, via e-mail, para a professora Anete [anetepsouza@gmail.com] e para o LMGS [lmgsmult@gmail.com]. O orientador pode enviar um único e-mail, informando a quantidade de material e o serviço que está autorizado a ser feito no decorrer do mês.
As amostras podem ser entregues pessoalmente em horário comercial, ou enviadas via Sedex10 acondicionadas em um isopor com gelo reciclável. Junto com as amostras, ou via e-mail, deverá ser enviado o Formulário de Requerimento de Serviço [DOC WORD/PDF] devidamente preenchido. As amostras não serão processadas caso os dados não sejam enviados.
AS AMOSTRAS DEVEM SER ENTREGUES EM PLACAS AXYGEN MODELO PCR-96M2-HS-C (OU SIMILAR). CASO A PLACA NÃO SEJA COMPATÍVEL COM O EQUIPAMENTO, INCLUIREMOS NA FATURA O VALOR DE UMA PLACA.Nosso endereço:
A/C Patrícia Zambon
Laboratório Multiusuário de Genotipagem e Sequenciamento
Av. Cândido Rondon, 400 – Barracão da Genética/UNICAMP
Cidade Universitária – Campinas/SP – CEP 13083-875
ENVIO DOS RESULTADOS
São enviados por e-mail os arquivos com dados brutos gerados em extensão *.fsa, sendo cada arquivo corresponde a uma amostra. Os arquivos podem ser analisados utilizando os softwares Peak Scanner ou GeneMapper (Applied Biosystems), ou GeneMarker (Softgenetics).
Os dados ficarão armazenados por seis meses. Após esse período serão descartados.
INFORMAÇÕES SOBRE CRITÉRIOS PARA COBRANÇA
Os dados para a nota fiscal devem ser enviados no Formulário de Requerimento do Serviço [DOC WORD/PDF] junto com as amostras.
No mês seguinte após receber os resultados será enviado pela Funcamp, via e-mail, a nota fiscal e o boleto bancário. Não é necessário enviar o comprovante de pagamento, pois o pagamento do boleto será verificado.
Para CRÉDITOS EM SERVIÇO, manteremos o valor do serviço por seis meses. Caso haja reajuste após esse período, será descontado do crédito o valor vigente na realização do serviço.
CRÉDITOS FEITOS ANTERIORES A JANEIRO DE 2019: manteremos o valor do serviço contratado até o final de Julho de 2019. Após esse período, será descontado do crédito o valor vigente na realização do serviço.
