Sequenciamento Sanger
Oferecemos serviço de sequenciamento de DNA a partir de produtos de PCR e plasmídios, utilizando o Genetic Analyser 3500XL, um sistema de análise de DNA de 24 capilares com a tecnologia Life Technologies – Applied Biosystems.
As reações de sequenciamento são feitas utilizando o BigDyeTM Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit e as corridas feitas em capilares de 50cm utilizando o polímero POP-7.
SEQUENCIAMENTO DE PRODUTOS DE PCR
Trabalhamos com duas opções de serviço:
I - o cliente envia o produto de PCR e os primers para que a reação de sequenciamento e a purificação sejam feitas em nosso laboratório.
II - o cliente prepara a reação de sequenciamento e a purificação das amostras em seu laboratório e envia a reação pronta para a corrida.
Serviço I
O produto de PCR
A qualidade da amostra de PCR é um dos fatores mais críticos no sequenciamento. Sabemos que é muito importante que a PCR esteja limpa e livre de contaminantes, pois a qualidade do sequenciamento é diretamente proporcional à qualidade da PCR.O produto de PCR deve ser analisado por eletroforese em gel de agarose para verificar se somente uma banda está presente. Caso positivo, a purificação pode ser feita com a combinação de duas enzimas (Ou com kit específico): Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP), que degrada os nucleotídeos não incorporados e a Exonuclease I (EXO), que degrada primers residuais e demais produtos simples fita não desejáveis.
8uL de PCR + 0,5uL de EXO (10U/uL) + 1uL de SAP (1U/uL).
Incubar em termociclador por 1 hora à 37°C, e depois 15 minutos à 80°C.
Conservar a 4°C.
Após a purificação dos produtos de PCR, é necessário fazer a quantificação. Consulte a tabela abaixo para determinar em que concentração suas amostras devem ser entregues.
SE FOR NECESSÁRIO DILUIR A AMOSTRA, UTILIZE ÁGUA ULTRAPURA
Os primers
Os primers para sequenciamento devem ser diluídos na concentração de 5pmol/uL. Os produtos de PCR deverão ser enviados já misturados com seu respectivo primer a ser usado na reação de sequenciamento. Para cada amostra de reação de sequenciamento a ser feita, deve ser enviado 0,5uL de primer a 5pmol/uL.Serviço II
Protocolo de preparação da reação de sequenciamento
Para a reação de sequenciamento:
BigDyeTM Terminator v3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Mix – 2,0uL
BigDyeTM Terminator v3.1 5x Sequencing Buffer – 0,4uL
Primer 5uM – 0,5uL
Produto de PCR – ver abaixo *
H2O ultrapura – q.s.p. 10uL
Total = 10uL
* A quantidade de PCR (em nanogramas) que deve ser adicionada à reação irá variar com o tamanho do seu produto. Consulte gráficos abaixo para verificar quantos nanogramas devem ser adicionadas à sua reação.
Por exemplo, se sua PCR tiver 1000bp você deverá colocar 20ng de PCR na reação de sequenciamento.
95°C por 1 minuto;
Repetir 26 ciclos de: 95°C por 20 segundos, 50°C por 20 segundos, 60°C por 4 minutos;
4°C ∞.
Protocolo de purificação das amostras
Para a purificação das amostras:
– Adicionar 2,5uL de EDTA 125mM e 25uL de etanol 100% em cada amostra;
– Selar a placa, inverter 4 vezes e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente;
– Centrifugar por 35 minutos a 4000 rpm e 4°C;
- Inverter a placa em papel absorvente e dar um spin até 250 rpm com aceleração e desaceleração nulas;
– Adicionar 30uL de etanol 70% gelado em cada amostra;
– Centrifugar por 10 minutos a 4000 rpm e 4°C;
– Inverter a placa em papel absorvente e dar um spin até 250 rpm com aceleração e desaceleração nulas;
– Deixar a placa secando overnight, protegida da luz.
As amostras devem ser enviadas secas em placas de 96, embrulhadas em papel alumínio para proteger da luz.
ENVIO DAS AMOSTRAS - VÁLIDO PARA OS SERVIÇOS I E II
As amostras deverão ser enviadas somente após autorização do orientador responsável pelo aluno, via e-mail, para a professora Anete [anetepsouza@gmail.com] e para o LMGS [lmgsmult@gmail.com]. O orientador pode enviar um único e-mail, informando a quantidade de material e o serviço que está autorizado a ser feito no decorrer do mês.
As amostras podem ser entregues pessoalmente em horário comercial, ou enviadas via Sedex10 acondicionadas em um isopor com gelo reciclável. Junto com as amostras, ou via e-mail, deverá ser enviado o Formulário de Requerimento de Serviço [DOC WORD/PDF] devidamente preenchido. As amostras não serão processadas caso os dados não sejam enviados.
AS AMOSTRAS DEVEM SER ENTREGUES EM PLACAS AXYGEN MODELO PCR-96M2-HS-C (OU SIMILAR). CASO A PLACA NÃO SEJA COMPATÍVEL COM O EQUIPAMENTO, INCLUIREMOS NA FATURA O VALOR DE UMA PLACA.Nosso endereço:
A/C Patrícia Zambon
Laboratório Multiusuário de Genotipagem e Sequenciamento
Av. Cândido Rondon, 400 – Barracão da Genética/UNICAMP
Cidade Universitária – Campinas/SP – CEP 13083-875
ENVIO DOS RESULTADOS - VÁLIDO PARA OS SERVIÇOS I E II
São enviados por e-mail os arquivos com extensão .AB1 contendo o eletroferograma das amostra, cada arquivo corresponde a uma reação feita. Os arquivos podem ser abertos utilizando os softwares Chromas, BioEdit ou Sequence Scanner (softwares de análise de sequência que podem ser obtidos gratuitamente na internet por download).
Os dados ficarão armazenados por seis meses. Após esse período serão descartados.
INFORMAÇÕES SOBRE CRITÉRIOS PARA COBRANÇA
Os dados para a nota fiscal devem ser enviados no Formulário de Requerimento do Serviço [DOC WORD/PDF] junto com as amostras.
No mês seguinte após receber os resultados será enviado pela Funcamp, via e-mail, a nota fiscal e o boleto bancário. Não é necessário enviar o comprovante de pagamento, pois o pagamento do boleto será verificado.
Para CRÉDITOS EM SERVIÇO, manteremos o valor do serviço por seis meses. Caso haja reajuste após esse período, será descontado do crédito o valor vigente na realização do serviço.
CRÉDITOS FEITOS ANTERIORES A JANEIRO DE 2019: manteremos o valor do serviço contratado até o final de Julho de 2019. Após esse período, será descontado do crédito o valor vigente na realização do serviço.
